Ensayo anidado de la reacción en cadena de la polimerasa específico para los genes de la toxina del cólera

Resumen

El candidato vacunal vivo contra el cólera CV638 contiene como ingrediente activo a la cepa atenuada genéticamente Vibrio cholerae 638, que se obtuvo a partir de la cepa de V. cholerae toxigénica C7258, mediante la remoción de los genes de la toxina del cólera (ctxAB). El uso de vacunas vivas atenuadas demanda ensayos que demuestren la estabilidad de la mutación atenuante; así como la ausencia de células infecciosas de tipo salvaje toxigénicas. El objetivo del presente trabajo fue diseñar un ensayo de PCR anidado específico para los genes ctxAB y evaluar su límite de detección en preparaciones del CV638 contaminadas con cantidades conocidas de la cepa toxigénica C7258Kn. Se diseñó un par de cebadores específicos para los genes ctxAB y se establecieron sus condiciones de empleo en cuanto a la temperatura de hibridación y concentración de MgCl2. El límite de detección del ensayo de PCR anidado de células de V. cholerae toxigénica C7258Kn se determinó en preparaciones de CV638 contaminadas artificialmente con cantidades crecientes de dicha bacteria. El límite de detección se evaluó estadísticamente y fue de ~50 unidades formadoras de colonias (UFC) de la cepa toxigénica por dosis de CV638, valor inferior que la menor dosis infectiva informada para V. cholerae (103 UFC). Una vez validado, el ensayo de PCR anidado puede ser empleado como control de pureza durante el control de calidad del CV638.