Crioconservación de una cepa mutante de micobacteria de interés biotecnológico

Resumen

La vitrificación (variante de la crioconservación) resulta ventajosa a escala celular, pues evita parcial o totalmente la cristalización del agua en el medio de congelación. La cepa Mycobacterium sp. NRRL B-3683 que biotransforma los esteroles en el precursor esteroidal de interés farmacológico androstadiendiona (ADD), se conservó por crioconservación y vitrificación. Los medios de protección para la crioconservación fueron medio caldo nutritivo enriquecido, al cual se le adicionó en un caso, glicerol al 10 % y en el otro, DMSO al 5%; la cepa fue congelada en dos variantes: a) inmersión directa en N2 (líquido) (-196 μC) y b) enfriamiento a 1 le/mm hasta -50 μC y después inmersión en N2 (líquido). Para la vitrificación se emplearon tres disoluciones vitrificadoras que se adicionaron al 50% del volumen total, pues el otro 50% fue de caldo nutritivo enriquecido . Ellas fueron: SV2 (20,5% DMSO, 15,5% acetamida, 10% propilénglicol y 6% PEG de 8 000), SV3 (20% DMSO, 15% dimetilformadida y 15% propilénglicol) y SV4 (25% glicerol y 25% propilénglicol). Se emplearon dos regímenes de congelación, a) tratamiento previo de adaptación que consistió en mantener las células en reposo por 20 min en la disolución al 25% de la concentración final, 40 min al 75% y 20 min al 85% para pasar al 100% de la concentración final de la disolución vitrificadora, b) sin tratamiento previo de adaptación. Además, se comparó la viabilidad en disoluciones de glicerol (10 %), SV2 y SV4 al cabo de 1, 15, 40 y 60 d de conservada la cepa De las disoluciones crioprotectoras, la mejor fue el glicerol (10%) en la variante de inmersión directa en N₂ (líquido) que mantuvo una viabilidad del 99% al cabo de los 2 meses de conservación. De las disoluciones vitrificadoras, la SV2 fue la mejor y no requirió tratamiento previo de adaptación. La capacidad biotransformadora del mutante conservado en glicerol (10%), SV2 y SV4, no se afectó.